Lorsque vous allez vous faire dépister pour le coronavirus dans un laboratoire d'analyse, on réalise un « test PCR ». Ce test a pour but d'amplifier le génome du coronavirus dans l'échantillon pour confirmer sa présence ou non. Sur quel principe se base-t-il ?
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Le test de dépistage pour le coronavirus est basé sur une méthode de biologie moléculaire appelée PCR (Polymerase Chain ReactionPolymerase Chain Reaction ou réaction en chaîneréaction en chaîne par polymérase). C'est une technique de routine utilisée dans pratiquement tous les laboratoires de biologie qui permet d'amplifier spécifiquement un ADN d'intérêt après plusieurs cycles de réactions biochimiques.
Dans le cas du SARS-CoV-2, on doit parler plus précisément de RT-PCRRT-PCR, car le génomegénome du virusvirus est une moléculemolécule d'ARNARN. Pour déterminer la quantité relative d'ARN du coronavirus dans les échantillons nasopharyngées, on utilise une variante de la RT-PCR appelé RT-PCR quantitative. Voici les étapes de ce test :
La première étape consiste à rétrotranscrire l'ARN du coronavirus en ADN complémentaire ou ADNcADNc qui sera par la suite amplifié. Cette étape est assurée par une ADN-polymérase-ARN-dépendante qui synthétise le brin d'ADNc simple brin à partir de la matrice ARN. Le second brin est synthétisé grâce à une amorce et une ADN polymérase,
A partir de là, les étapes sont les mêmes qu'une PCR. Un cycle de PCR se compose des étapes suivantes :
1er étape du test PCR : la dénaturation
La première étape est la dénaturationdénaturation. Classiquement, il s'agit de chauffer l'échantillon pendant 10 à 15 minutes à 95 °C. Lors de cette étape, les deux brins de l'ADNc se séparent. Lorsque on entame un nouveau cycle d'amplification, c'est étape est plus courte et permet de décrocher la polymérase.
2è étape du test PCR : l’hybridation
Lors de l'hybridationhybridation, qui se déroule à une température comprise entre50 et 60 °C, les amorces sont de courtes séquences ADN qui se fixent spécifiquement à l'ADN à amplifier. Les amorces fonctionnent par paires : une sens et une anti-sens. L'amorce sens (5'-3') servira de base pour l'élongationélongation du brin anti-sens et l'amorce anti-sens (3'-5') servira de base pour l'élongation du brin sens (5'-3'). La température de cette étape est choisie en fonction du Tm des amorces qui dépendent de leur séquence.
3ème étape du test PCR : l’élongation
L'élongation est réalisé classiquement par la Taq polyméraseTaq polymérase, une enzymeenzyme extraite de bactériesbactéries sous-marines qui est active à 72 °C. La Taq polymérase se fixe a l'amorce et synthétise un brin d'ADN complémentaire à la matrice grâce aux désoxyribonucléotides disponibles dans le milieu. La longueur de cette étape dépend de la taille de l'amplicon.
Après cette étape, le cycle reprend du début. Les cycles se succèdent jusqu'à que la quantité d'amplicon est suffisamment importante pour être détecté. Lorsqu'il s'agit d'une PCR quantitative, on marque l'ADN d'intérêt avec une sonde fluorescente qui permet de suivre l'augmentation de la fluorescence, et donc de la quantité d'ADN, au fil des cycles. Cette méthode s'oppose à la PCR en point final où on analyse le produit de la PCR à la fin de tout les cycles par une électrophorèseélectrophorèse sur gelgel d'agaroseagarose.
Toutes ces étapes sont totalement automatisées et réalisées dans un appareil appelé thermocycleur. Les différents réactifsréactifs nécessaires à la PCR sont vendus par les fournisseurs de produit de laboratoire. Il existe de nombreux kits différents, avec des caractéristiques différentes. Le ministère de la Santé a mis en ligne la liste des kits autorisés pour le dépistage du coronavirus.
