Vaccins antigrippaux : la génétique inverse et les cultures cellulaires

En matière de vaccinsvaccins antigrippaux, la recherche pousse sans cesse le développement de nouvelles techniques. Voyons ici celle de la génétiquegénétique inverse et les cultures cellulaires.

La culture cellulaire. © hellopro.fr

En virologie moléculaire, la génétique inverse définit la génération de virus dont le génomegénome est produit à partir d'ADNcADNc (ADN complémentaire). L'ARNARN viral est isolé et transcrit en ADNc par une transcriptase inversetranscriptase inverse. L'ADNc est amplifié par amorces spécifiques des segments viraux puis cloné (Marsh and Tannock 2005 42).

La préparation des virus réassortis entrant dans la composition des vaccins fait appel à la confection de cellules par deux souches de virus influenzavirus influenza et peut générer théoriquement 254 (2⁸) virus recombinés. La sélection indispensable des « bons réassortis » nécessite des procédures d'analyse et de vérification longues et dispendieuses. Le développement des techniques de génétique inverse permet de réduire le nombre de virus réassortis résultants.

Création d'une souche vaccinale par réassortiment entre une souche saisonnière et une souche mère. © National Institute of Allergy and Infectious Diseases (NIAID)

Les techniques de génétique inverse (Neumann, Whitt et al. 2002 48)

Les premiers systèmes de génétique inverse appliqués aux virus influenza A font appel à des virus helper (virus qui assure les fonctions manquantes d'un virus défectif). Un complexe de ribonucléoprotéines (RNP) est produit par la synthèse in vitroin vitro des segments d'ARN viral (vRNA) en présence des polymérasespolymérases et de NP. Ce complexe représente l'unité de réplicationréplication minimale des virus influenza A. Des cellules eucaryoteseucaryotes sont ensuite transfectées avec ces RNP et infectées par un virus influenza A helper. L'infection cellulaire par le virus helper génère des virus possédant le gènegène correspondant à l'ADNc cloné.

Une autre méthode, utilisant le même type de système, est basée sur la transcriptiontranscription in vivoin vivo des vRNA par l'ARN polymerase I (pol I) cellulaire ; il y a production intracellulaire des complexes RNP. Dans ce système, l'ADNc codant pour les vRNA est inséré entre les séquences promoteur et terminale de pol I. Les complexes fonctionnels RNP sont générés à l'aide d'un virus helper infectant (Neumann, Watanabe et al. 1999 47). Ces systèmes utilisant des virus influenza helper nécessitent également une sélection des virus transfectants parmi la population des helper.

En 1999, un système de génétique inverse a permis la génération de virus influenza A à partir d'ADNADN complémentaire exclusivement. Des cellules humaines embryonnaires rénales (cellules 293T) sont transfectées avec huit plasmidesplasmides, chacun codant un segment d'ARN viral d'une souche H1N1, encadré par le promoteur (d'origine humaine) et la séquence de terminaison de l'ARN polyméraseARN polymérase I, auxquels s'ajoutent quatre plasmides pour l'expression des protéinesprotéines NP et le complexe polymérase (PA, PB1, PB2). Ce système à 12 plasmides permet de produire en 48 heures plus de 10⁶ unités formatrices de plages par millilitre (ml) de supernatant (Neumann, Watanabe et al. 1999 47).

Par la suite, des systèmes de génération de virus influenza A à partir de huit plasmides ont été développés. Chaque plasmide contient une copie d'un des huit segments de l'ARN viral : l'ADNc est inséré entre le promoteur et le terminateur de pol I ; cette unité de transcription est encadrée par le promoteur de pol II (ARN polymerase II) et un signal de polyadénylation (signal de fin de gène). Après transfectiontransfection, l'ARN viral antisens (de polarité négative) est synthétisé par la pol I cellulaire, et la transcription par la pol II résulte en la synthèse de brins d'ARNm (ARN messagerARN messager) de polarité positive traduits ensuite en protéines virales. La réplication virale est initiée dès la synthèse des protéines du complexe polymérase virale (PB1, PB, PA, NP). Ce système a montré son efficacité dans la génération de virus influenza A H1N1 et H6N1 en cultures de cellules 239T et MDCK ; il a permis également la génération de virus réassortis entre ces mêmes souches (Hoffmann, Neumann et al. 2000 30).

Création d'une souche vaccinale antigrippale par un système à huit plasmides. © National Institute of Allergy and Infectious Diseases (NIAID)

D'autres systèmes de génétique inverse utilisant un nombre réduit de plasmides ont été expérimentés, en combinant plusieurs gènes viraux dans le même plasmide :

• un plasmide pour la transcription des huit ARN viraux ; chacune des huit unités de transcription comprend le promoteur d'origine humaine de pol I, l'ADNc de polarité négative codant un segment du génome viral, et la séquence terminator de pol I d'origine murine ;
• un système à deux plasmides basé sur pol I : un plasmide contenant deux unités de transcription, une pour HA, une pour NA, selon le même schéma que ci-dessus ; un second plasmide avec six unités de transcription correspondant aux six autres segments viraux (PB1, PB2, PA, NP, NS, M) ;
• un système à deux plasmides basé sur pol II : un plasmide pour la transcription de PA, PB1, PB2 ; chacune des trois unités de transcription contient l'ARNm codant pour la protéine virale, intercalé entre le promoteur de pol II et une séquence de polyadénylation ; le second plasmide est construit sur le même modèle pour la transcription de l'ARNm de la protéine NP ;
• en combinant ces unités de transcription, la génération de virus influenza A dans des cultures de cellules Vero est plus importante 48 heures après la transfection que dans les systèmes à 12 plasmides. L'utilisation d'un ou deux plasmides pour la synthèse des vARN en combinaison avec le plasmide codant pour le complexe polymérase basé sur pol II, donne des titres de l'ordre de 2.5x10⁶ particules virales par ml, 72 heures après la transfection. De même, la combinaison des sous-unitéssous-unités du complexe polymérase dans le même plasmide augmente la capacité de génération virale (Neumann, Fujii et al. 2005 46).

La génération de virus à partir de systèmes de transfection à huit plasmides et moins, réduit le temps nécessaire à la création de virus potentiellement candidats à l'élaboration de vaccins et globalement en diminue le coût de préparation.

La construction de souches vaccinales contre les virus influenza A

Les systèmes de transfection de l'ADN à huit plasmides ont été testés pour la génération de souches vaccinalessouches vaccinales saisonnières et la constructionconstruction de virus circulant en Asie du sud-est en 1997 (Hoffmann, Krauss et al. 2002 29) :

• la souche A/PR/8/34 (H1N1) : souche mère pour la production des vaccins inactivés humains, obtenue à l'aide de huit plasmides, chacune codant un segment de l'ARN viral ;
• les virus réassortis H1N1 et H3N2, souches recommandées par l'OMSOMS pour la fabrication des vaccins saisonniers de 2001/2002 ;
• le virus réassorti des souches H9N2 et H6N1 circulant en Asie, présumées être les précurseurs du virus H5N1virus H5N1 responsable des cas de grippe aviairegrippe aviaire à Hong Kong en 1997.

Dans ces deux derniers cas, les virus réassortis sont générés par la transfection en culture mixte de cellules 293T et MDCK, avec six plasmides contenant les six gènes internes de la souche mère PR8 et deux plasmides codant les sous-types NA et HA choisis ;

• les capacités de croissance de la souche recombinée PR8 sont identiques à celles de la souche sauvage ; les caractéristiques antigéniques des virus réassortis sont identiques à celles des virus parents. Les résultats sont en faveur de l'utilisation de cette technique pour la génération rapide et reproductible de souches vaccinales

Avantages des techniques de génétique inverse

La génétique inverse utilise les cellules en culture, permettant la génération des souches vaccinales à partir de cellules approuvées pour leur utilisation dans le développement des vaccins humains (cellules qualifiées).

• Elle permet de maîtriser la virulence des souches prototypes, par manipulations au niveau du motif multibasique d'acides aminésacides aminés près du site de clivageclivage de HA.
• Elle ne nécessite pas de système de sélection des virus réassortis pertinents parmi tous les virus recombinés.
• Les plasmides codant les gènes de la souche mère sont disponibles par avance, seuls les gènes HA et NA nécessitent d'être clonés pour chaque vaccin (Luke and Subbarao 2006 41).
• Les procédures de génétique inverse doivent être adaptées au niveau de biosécurité approprié en fonction des agents biologiques manipulés. L'OMS a édité, à ce sujet, un guide de développement des souches vaccinales de référence par génétique inverse (OMS 2005 3).

Les cultures cellulaires 

Les souches vaccinales utilisées dans les vaccins inactivés sont produites sur des œufs de poules fertilisés depuis un demi-siècle. Le risque de contaminationcontamination des œufs par des rétrovirusrétrovirus aviaires n'est pas nul et peut compromettre l'innocuité des préparations vaccinales. Les techniques de génétique inverse ont permis le développement de souches vaccinales contre le virus A (H5N1) pour lesquelles on a montré l'immunogénicitéimmunogénicité et l'absence de pouvoir pathogènepathogène. Les premiers essais de transfert génétique ont utilisé des lignées cellulaires 293T, très adaptées à cette technique (Subbarao, Chen et al. 2003 59). Mais ces lignées ne sont pas validées actuellement par les instances qui contrôlent la production de vaccins humains, pour la raison qu'elles n'ont pas encore fait l'objet de recherche sur leur potentiel oncogèneoncogène ou infectieux. Les cellules Vero quant à elles, bénéficient d'une licence d'utilisation pour la fabrication des vaccins antipoliomyélitiques et sont en cours de validation pour la fabrication des vaccins antigrippaux.

L'utilisation des cellules Vero dans les procédures de génétique inverse a montré ses performances dans la génération de virus réassorti H5N1/PR8 non pathogène, toutes les procédures ayant fait l'objet d'une démarche de contrôle et d'assurance qualité pour des systèmes à 12 plasmides (Nicolson, Major et al. 2005 50) et pour des systèmes à huit plasmides (Webby, Perez et al. 2004 64).