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Une mitose est observée au microscope à épifluorescence grâce à différents fluorochromes (l'ADN en bleu, la tubuline en rouge et une protéine centromérique en vert). © F. Lamiot, CC by-sa 3.0
Le microscope en fluorescence fait partie de la grande famille des microscopes optiques.
Technique du microscope en fluorescence
La fluorescence est la propriété que certains corps ou moléculesmolécules ont à émettre une lumièrelumière après avoir été excités avec une lumière d'énergieénergie supérieure. Ainsi, un objet excité par une longueur d'ondelongueur d'onde émettra une fluorescence à une longueur d'onde supérieure.
La technique du microscopemicroscope en fluorescence est donc la même qu'un microscope optique, sauf que la lumière utilisée n'est pas blanche, mais possède une gamme définie de longueur d'onde. Toutefois, en général, la lumière arrive sur l'échantillon par le haut (épi-fluorescence) et non par-dessous.
À l'émissionémission, on peut alors utiliser des laserslasers possédant une longueur d'onde unique ou des filtres d'excitation ne laissant passer que la lumière de longueur d'onde désirée sur l'échantillon. Après excitation de l'échantillon, celui-ci émet à son tour une lumière d'une longueur d'onde différente. On peut utiliser des filtres permettant de n'observer que la longueur d'onde désirée, c'est-à-dire les photonsphotons d'émission, et bloquer les photons d'excitation.
Utilisation du microscope en fluorescence
Le microscope en fluorescence permet de visualiser des objets qui sont naturellement fluorescents (chlorophyllechlorophylle...), ou des molécules rendues fluorescentes pour mieux les observer (protéines couplées à la GFP, DAPI pour l'ADN, fluorochromes...).
Des techniques utilisant cette microscopie ont été développées :
- immunofluorescence (marquage à l'aide d'un anticorps couplé à un fluorochrome) ;
- FISH ou hybridationhybridation fluorescente in situ pour marquer des séquences nucléotidiques grâce à des oligonucléotidesoligonucléotides couplés à des fluorochromes ;
- FRET ou transfert d'énergie entre molécules fluorescentes permet de visualiser si deux molécules interagissent ;
- BIFC ou complémentation de fluorescence bimoléculaire permet de visualiser une interaction en reconstituant l'intégritéintégrité d'un fluorochrome à l'aide de deux molécules...
